HE染色是病理实验中最用的一种基础染色方法。染色后可清晰地反映出组织结构、组织类型、细胞层次等,在此不赘述。
俗话说,漂亮的染色干篇一律,糟糕的染色总能丑出自己的特色。为了让大家染好,小编手敲了下面的内容,希望能助力一二。有关于组织固定、脱水、透明、包埋和制片的内容,小编会穿插在内容中。
Q1: HE染色最常见的红蓝失调
答: (1)偏蓝色:苏木素染色过深,分化不够;伊红试剂过期;伊红染色时间太短,分化过度。.(2)偏红色:苏木素染色过浅,分化过度;组织固定不佳,细胞核不着色;脱蜡不彻底,苏木素染不上;苏木素氧化成熟不够;伊红染色过深,分化不足。
Q2: HE染色后出现的大白色斑块或斑点
答:脱蜡前烤片温度偏低,时间过短,蜡未完全融化;切片在脱蜡溶剂中停留时间过短;脱蜡溶剂使用太久,得更新。
Q3:细胞核染色过浅,颜色暗淡
答:切片在苏木素染液中停留过短,或苏木素过度氧化失效,或分化时间太长。对策:重新染色。将组织切片放入0.01%氢氧化纳、0.5%安水、饱和的碳酸氢钠溶液、乙醇溶液,每个35min即可,接着重新染色。可以适当地组织的嗜碱性以增强核染色,如Zenker液固定的切片可放入5%碳酸氢钠溶液中3h,自来水冲洗5-10min染色,或Bouin液固定的切片可放入5%碳酸氢钠溶液中1h,自来水冲洗10min染色。
Q4:细胞核染色过深,胞浆着蓝色
答:切片在苏木素染液中停留过长;或切片太厚;或分化时间太短。这种情况首先镜下看看切片厚度(最佳厚度1-2层细胞核),要么重新染色,要么重新制片。
Q5:细胞核呈棕红色改变
答:苏木素染液过度氧化;或苏木素染色后反蓝不足导致。应该立即更换苏木素染色液。或在流动自来水(一般自来水PH7.5-7.8),或在稀释的安水溶液,或在0.2%碳酸氢钠中适当浸泡,这些步骤均可一定程度地加强苏木素染色后的反蓝效果。Q6:伊红染色较淡
答:伊红的PH改变了(PH可能已大于5);或反蓝液体未漂洗干净,残留后影响胞浆嗜酸性染色;或者切片太薄并且在随后的脱水步骤停留过久。对策:检查伊红染色液PH,可采用乙酸调至4.6-5.0,根据以上提示,调整实验步骤。
Q7；染色时切片脱落怎么办
答;(1)血栓、坏死或硬度较大的组织本身在染色时就极易脱落,应小心操作。(2)组织脱水、透明不佳,石蜡未完全渗入,脱蜡时组织收缩,复水时组织又吸水膨胀,造成脱片;还可能是组织脱水、透明过度,且浸蜡温度过高,导致组织变硬变脆,既不容易切片也极易在染色过程中脱片。对策:发脆发硬的组织可用棉签蘸5%安水或2%冰乙酸溶液涂抹在组织表面10-15秒。然后精修出组织面,放入冰水混合物中泡1min,再切片。(3)切片太厚;切片破碎,不整齐;展片时水温过低,展片不充分导致组织与玻片贴合不紧密;烤片时间和温度过短过低,或过久过高,一般使用防脱玻片烤片仅需30min即可。(4)染色前入水步骤不够,组织吸水后快速膨胀,导致脱片;染色过程中漂洗粗暴,振荡过度;反蓝时间太久,反蓝液碱性过强,可以采用自来水反蓝,一般自来水PH7.5-7.8,效果很好。(5) 1%盐酸乙醇分化时脱片。分化的原理是利用盐酸电离出的氢离子,改变组织表面电荷,使得吸附的染料脱落。由此看来,乙醇的作用并不大。并且分化液中的乙醇会使组织快速脱水而收缩,在随后漂洗时组织又快速吸水膨胀,极易脱片。因此完全可以改用1%盐酸水溶液作为分化液。
Q8:切片染色不均匀,有片状的弱着色区存在
答:(1)取材时组织太厚,固定过久,导致深部组织固定不佳,而表浅组织过度固定,而透明、脱水、浸蜡均是如此,这样在后期染色时就会出现染色不均匀。应该将厚的组织剖开固定。(2)制片过程有问题,切片厚薄不一,或者有刀痕,或组织与玻片间存在气泡。同一张切片厚薄不一,一般都是在制片时,刀片固定不佳或刀片钝或刀片与组织角度不佳(一般最佳角度为59)(3)脱蜡前未烘烤,脱蜡时间过短或脱蜡液使用过久,导致脱蜡不彻底。(4)染色液过少,着色不均匀;或染色时部分组织干涸而另一部分湿润,这样会导致组织吸附染料的能力不一。(5)分化不当。
Q9:成片的染色模糊不清,灰染
答:(1)组织未及时固定,部分自溶;或固定不佳,深部组织未处理到。这种只能重新固定了。(2)尽管乙醇也是一种固定液,但尽量少用或不用,因为其会导致组织发硬变脆,染色效果不好。(3)包埋时蜡的温度过高,或切片后烤片时间和温度过久过高都不好,可能会导致无法染色。(4)脱蜡不彻底;染料有问题;分化过度导致的颜色变淡,镜下组织界限不清;染完后的脱水和透明不佳,水雾残留在组织上。(5)通风窗中(防止空气中的水雾) ,戴口罩操作封片(减少哈气带来的水雾) 。
Q10:不管怎么操作,始终无法染色或淡染
答:这种情况一般因为组织固定时采用了酸性甲醛;或者组织在甲醛中浸泡时间太长;或者久置的甲醛变性分解为甲酸。补救:防患于未然,要么使用新鲜的中性甲醛固定,要么在存放的甲醛中加一点碳酸钠中和甲酸。对于已经固定的组织可考虑再次固定。对于已经制出的片子,染色前采用5%重格酸钾溶液浸泡半小时以上,然后自来水漂洗5min,可改善染色。也可以将切片放入3%硫酸铁铵溶液中,补充染色媒介,增强苏木素与组织的亲和力(苏木素染色必须要媒介才能染上,单纯的苏木素与组织的亲和力很弱)