临床常规免疫组化检测通常采用辣根过氧化酶显色系统(即DAB显色) ,阳性反应呈棕黄色颗粒。但在黑素瘤组织中,免疫组化阳性的棕黄色颗粒常与组织原有黑素颗粒混淆,难以鉴别,若黑素颗粒较多,结果判断较困难。既往有文献报道,采用Giemsa染液进行后续复染能·够很好的使组织内黑素颗粒显示为墨绿色,以区分DAB显色阳性的棕黄色颗粒[1]。本文采用甲本胺蓝染料在苏木镜复染的基础上进行双重复染,背景细胞清晰,黑素颗粒取得与Giemsa染液复染相似的结果,效果满意,现报道如下。
材料与方法
1.1材料
选用中国医学科学院皮肤病研究所病理科存档的恶性皮肤黑素瘤标本54例,均经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋, 4um厚切片,采用SP法进行常规免疫组化染色。一抗S100蛋白多克隆抗体及二抗、DAB显色剂均为福州迈新公司产品。甲本胺蓝染液、Giemsa染液为实验室自配。
1.2方法
2.1染液配制(1)甲本胺蓝原液:将1g甲本胺蓝溶于100ml蒸馏水中,即得到甲本胺蓝原液。(2)甲本胺蓝工作液:将甲本胺蓝原液用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.8,不含NaCl)按1:20稀释配成,现用现配。

1. Giemsa原液: 0.75gGiemsa溶于50ml甘油中,加热至50~60℃,每隔1摇荡1次, 7~8次后再加甲醇混合后静置12h,即得到Giemsa原液。
2. Giemsa工作液:将Giemsa原液用0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.8,不含NaCl)按1: 20稀释配成,现用现配。

1.2.2染色步骤
苏木镜单独复染步骤:(1)切片常规脱蜡至水,按免疫组化染色常规步骤进行,苏木镜复染, 1%盐酸乙醇分化,水洗。(2)常规脱水、透明、封固。
Giemsa单独复染步骤[1]:1)切片常规脱蜡至水,按免疫组化染色常规步骤进行, DAB显色,水洗。(2)滴加Giemsa工作液,覆盖全部组织,置室温中30min,水洗。(3)用1: 500冰乙酸液分化,显微镜下观察,黑素颗粒呈墨绿色,与DAB染色阳性棕黄色颗粒区别明显,水洗中止反应。4)常规脱水、透明、封固。
苏木镜-甲本胺蓝双重复染步骤(1)切片常规脱蜡至水,按免疫组化染色常规步骤进行,苏木镜复染,1%盐酸乙醇分化,水洗。(2)滴加甲本胺蓝工作液,覆盖全部组织,置室温中30min,水洗。(3)用1: 500冰乙酸液分化,镜下观察,黑素颗粒呈墨绿色,与DAB染色阳性棕黄色颗粒区别明显,水洗中止反应。4)常规脱水、透明、封固。
结果同时进行苏木镜单独复染、Giemsa单独复染、苏木镜-甲本胺蓝双重复染、苏木镜Giemsa双重复染4种染色方法进行染色,并用磷酸盐缓冲液代替一抗、二抗作为阴性对照。苏木镜单独复染结果显示免疫组化阳性的棕黄色颗粒与细胞内原有黑素颗粒颜色相近,不易区分;免疫组化阳性颗粒经后3种方法复染后仍为棕黄色,组织内原有黑素颗粒变为墨绿色,区别明显(图1~5)

讨论
按照传统方法Giemsa单独复染者背景为淡锈红色,与DAB染色阳性的棕色颗粒色差偏小,有重叠效应,且背景细胞无细胞核。苏木镜-甲本胺蓝双重复染者黑素颗粒染色效果同Giemsa单独复染者,保留了Giemsa复染不影响DAB棕黄色阳性结果的同时又改变了原有黑素颜色的直观优点,其背景为蓝色,与苏木镜复染背景颜色一致,易与棕色颗粒区分,且不影响苏木镜的显色,背景细胞胞核清晰可见,免疫组化阳性棕黄色颗粒、墨绿色黑素颗粒、蓝色胞核三者色差明显,便于直观区分。苏木镜Giemsa双重复染者黑素显绿效果同苏木镜-甲本胺蓝双重复染者,但因背景为淡锈红色,与免疫组化棕黄色颗粒颜色有叠加,对部分黑素瘤细胞内少许黑素的识别有所干扰。甲本胺蓝原液较Giemsa原液的配制步骤更为简单方便。因此,苏木镜-甲本胺蓝双重复染可以简单有效的应用在黑素瘤免疫组化染色中。