中科光华（西安）智能生物科技有限公司
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试剂、抗体、技术服务、实验室仪器 / 设备
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公司新闻/正文
搞定免疫组化，或许你还差这些
人阅读 发布时间：2022-11-15 11:10
一提到免疫组化（IHC)实验，繁琐的操作步骤总是叫人头疼。实际IHC 实验并不算难，但由于操作步骤较多，因此造成影响实验结果的因素较多，可谓是稍有疏忽就全盘皆输，可以用九九八十一难来形容了。但也不是没有办法解决，现在我们就将免疫组化操作中常见问题和解决方法汇总给大家，希望能帮助到你。
1.切片染色深
问题原因：一抗浓度过高是造成切片染色深常见的原因之一。
解决方法：是在每次使用新抗体前对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，包括即用型的抗体也同样需要进行测试，不能只简单的按照说明书进行染色
2.时间过长或温度过高影响实验结果
问题原因：忽视操作规程，没有严格控制时间，因遗忘而造成时间延长或温度过高。
解决方法：实验人员应当严格执行操作规程，随身佩带报时表或报时钟，及时提醒。现在流行的二步法敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
3.DAB显色不理想
问题原因：DAB 变质或显色时间太长。
解决方法：DAB 最好现用现配，如有沉渣，应进行过滤后再使用。当染色片太多或使用染色机，导致无法及时进行终止操作时，也应该尽量对新的，或使用频率不高的抗体，进行显色时的监控，避免显色时间过长。
配制好的 DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应，从而降低 DAB 的效力；像未用完的 DAB 存放在冰箱里，需要的时候再取用的这种行为也是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，待达到理想的染色程度时，应立即终止反应。
4 .组织变干
问题原因：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因
解决方法：实验人员在操作过程中要做到仔细认真，并采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，达到有效的避免液体流失，提高操作速度的效果。
5.切片背景着色
问题原因：切片在缓冲液或修复液中浸泡时间大于 24 小时，并切放置在室温下，特别是炎热的夏天，就会出现背景着色。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4ºC 冰箱过夜，对结果无明显影响。
解决方法：室温下不可存放时间太长，尤其是夏天。切片和修复液如需过夜，最好存放在 4ºC 冰箱内。
6.切片不显色或者背景着色
问题原因：一抗变质、质量差的多克隆抗体，是导致切片不显色或者背景着色的主要原因。
解决方法：一定要注意一抗的有效期，用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
7.非特异性染色
问题原因：忘记血清封闭，在免疫组化中使用封闭血清，可以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。
解决方法：封闭血清一般选择和二抗来源相同的，因此常用山羊血清。有时也会使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不可与一抗来源相同。
8.操作过程中脱片
（1）可能是黏附载玻片质量的问题，建议尝试更换载玻片。
（2）组织切的不好，可能是切片机刀片较钝造成切片切的厚、不均匀，或者是切片机操作者手法不熟练等。
（3）可能是组织的问题，比如癌症组织有坏死情况时，也容易造成脱片。
（4）烘烤结果不理想，可能是烘烤时间较短或温度不够等。
（5）操作时甩动幅度过猛，有脱片嫌疑的切片最好不甩或轻轻甩，可用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（6）修复过程出现问题，比如在抗原修复时，高压时间过长，或者放进 100 度修复液时不够平稳，也容易出现脱片的情况。此外，用 EDTA 修复比柠檬酸更容易脱片。
（7）一旦见到有组织漂起来，在操作时就要更加谨慎，使用 PBS 的时候尽量泡，不要冲。
中科光华（西安）智能生物科技有限公司（网址：http://www.bioaitech.com),是一家专业为生命科学研究提供一站式服务的新型高科技企业。公司拥有独立的病理学实验平台、免疫学实验平台、生化实验平台和生物信息学等平台。提供各种组织生物样本技术服务、研发、产品开发、生产和销售。公司引进的全套先进设备仪器建立了一整套以生物组织为主的产品以及技术服务。与国家、省级公共实验平台及国内知名高校生命科学研究实验室建立了广泛的合作关系。 拥有庞大的石蜡、冰冻组织芯片及组织库，拥有专业的技术服务团队，无论是形态病理学服务还是分子生物学服务，尤其是具有丰富的免疫组化实验经验，公司拥有一批生物医学背景、热爱生命科学研究的留美博士和国内知名高校的博士、硕士研究生、高级技师和经验丰富的实验操作技术人员组成，并由主任级病理医生出具实验报告，为客户提供最可靠最优质的服务体验。公司承接整体课题研究，可开展分子生物实验技术、细胞实验技术、病理实验技术、荧光原位杂交技术等服务，并提供有关技术攻关、研发等相关服务。我们将致力于全心全意为各大知名企业，高校，研究所及医院提供优质的服务。
1.切片染色深
问题原因：一抗浓度过高是造成切片染色深常见的原因之一。
解决方法：是在每次使用新抗体前对其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到适合自己实验室的理想工作浓度，包括即用型的抗体也同样需要进行测试，不能只简单的按照说明书进行染色
2.时间过长或温度过高影响实验结果
问题原因：忽视操作规程，没有严格控制时间，因遗忘而造成时间延长或温度过高。
解决方法：实验人员应当严格执行操作规程，随身佩带报时表或报时钟，及时提醒。现在流行的二步法敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的 1 小时，而是 30 分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
3.DAB显色不理想
问题原因：DAB 变质或显色时间太长。
解决方法：DAB 最好现用现配，如有沉渣，应进行过滤后再使用。当染色片太多或使用染色机，导致无法及时进行终止操作时，也应该尽量对新的，或使用频率不高的抗体，进行显色时的监控，避免显色时间过长。
配制好的 DAB 不应存放时间太长，因为在没有酶的情况下，过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应，从而降低 DAB 的效力；像未用完的 DAB 存放在冰箱里，需要的时候再取用的这种行为也是不可取的。DAB 的显色最好在显微镜下监控，待达到理想的染色程度时，应立即终止反应。
4 .组织变干
问题原因：修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因
解决方法：实验人员在操作过程中要做到仔细认真，并采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈，达到有效的避免液体流失，提高操作速度的效果。
5.切片背景着色
问题原因：切片在缓冲液或修复液中浸泡时间大于 24 小时，并切放置在室温下，特别是炎热的夏天，就会出现背景着色。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将装有切片和修复液的容器放在 4ºC 冰箱过夜，对结果无明显影响。
解决方法：室温下不可存放时间太长，尤其是夏天。切片和修复液如需过夜，最好存放在 4ºC 冰箱内。
6.切片不显色或者背景着色
问题原因：一抗变质、质量差的多克隆抗体，是导致切片不显色或者背景着色的主要原因。
解决方法：一定要注意一抗的有效期，用新买抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。
7.非特异性染色
问题原因：忘记血清封闭，在免疫组化中使用封闭血清，可以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景。
解决方法：封闭血清一般选择和二抗来源相同的，因此常用山羊血清。有时也会使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不可与一抗来源相同。
8.操作过程中脱片
（1）可能是黏附载玻片质量的问题，建议尝试更换载玻片。
（2）组织切的不好，可能是切片机刀片较钝造成切片切的厚、不均匀，或者是切片机操作者手法不熟练等。
（3）可能是组织的问题，比如癌症组织有坏死情况时，也容易造成脱片。
（4）烘烤结果不理想，可能是烘烤时间较短或温度不够等。
（5）操作时甩动幅度过猛，有脱片嫌疑的切片最好不甩或轻轻甩，可用卫生纸从边缘上慢慢吸水。
（6）修复过程出现问题，比如在抗原修复时，高压时间过长，或者放进 100 度修复液时不够平稳，也容易出现脱片的情况。此外，用 EDTA 修复比柠檬酸更容易脱片。
（7）一旦见到有组织漂起来，在操作时就要更加谨慎，使用 PBS 的时候尽量泡，不要冲。
中科光华（西安）智能生物科技有限公司（网址：http://www.bioaitech.com),是一家专业为生命科学研究提供一站式服务的新型高科技企业。公司拥有独立的病理学实验平台、免疫学实验平台、生化实验平台和生物信息学等平台。提供各种组织生物样本技术服务、研发、产品开发、生产和销售。公司引进的全套先进设备仪器建立了一整套以生物组织为主的产品以及技术服务。与国家、省级公共实验平台及国内知名高校生命科学研究实验室建立了广泛的合作关系。 拥有庞大的石蜡、冰冻组织芯片及组织库，拥有专业的技术服务团队，无论是形态病理学服务还是分子生物学服务，尤其是具有丰富的免疫组化实验经验，公司拥有一批生物医学背景、热爱生命科学研究的留美博士和国内知名高校的博士、硕士研究生、高级技师和经验丰富的实验操作技术人员组成，并由主任级病理医生出具实验报告，为客户提供最可靠最优质的服务体验。公司承接整体课题研究，可开展分子生物实验技术、细胞实验技术、病理实验技术、荧光原位杂交技术等服务，并提供有关技术攻关、研发等相关服务。我们将致力于全心全意为各大知名企业，高校，研究所及医院提供优质的服务。
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