免疫组化技术现已应用于病理检查的各个方面，扩大了病理学在临床医学中的应用，其意义远超一般人的认知，尤其在倡导循证医学和精准医学的今天，免疫组化越来越成为病理学不可或缺的好帮手，那么，想要做好免疫组化，这些，你都知道吗？
          在判断免疫组化最后结果时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。
        因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式是由组织没有及时的固定所引起的。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就会发生扩散。这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。
        因此，为达到免疫组化染色的要求，对离体的组织尽快进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
        组织块取材不能太大或厚，才能更好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，染色失败，或者为此反复操作，会造成人力物力的浪费，病理报告延期发出等。
        应用于免疫组化染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利于染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，会不均匀，颜色深浅不一。
      如果切片有汽泡，在烘烤时，汽泡破裂会影响汽泡周围的组织，形成深浅不一的染色。如果切片有邹折，染色后邹折的地方也会有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引起混淆。
        免疫组化染色前的准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。
      新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡 4 小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达 2 小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了-氨基-三乙氧基-硅完 (3-Aminopropyl triethoxy-silane) 的稀释液 (1：50 用丙酮或无水乙醇稀释都可以)中硅化 10 分钟，后经无水乙醇洗 2 次，烘干即可使用。
         应用于免疫组化染色的切片的质量要求很高，尤其是切片的附帖程度。为此，切片在 60℃ 的恒温干燥箱中烘烤 2-5 小时最为合适。 
       这是因为：抗原可耐受如此的温度，病理科一般使用的石蜡，其熔点在 60℃ 左右，组织浸蜡时，浸蜡箱中的温度，一般都调在 65℃ 左右，组织在这样温度中要浸泡 2 小时以上，才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了 65℃ 的温度考验，保存下来的抗原，都已具有耐热性。另外，经上述时间烘烤出来的切片，附贴牢固，抗原保存好，染色成功率达 100%，保证了病理诊断的及时性和准确性。
      特需要注意的是，不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片，烘烤后应尽快进行染色。如果切片切完后，迟迟不进行染色，存放于室温中或工作冰箱中，切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失，甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片，即行染色，染多少张切多少张，这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。
         蜡不溶于水，不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂，处理足够的时间，才能将其除去。如果脱蜡不干净，少许蜡存留于切片上，将会引起染色不均，阳性物时隐时现，背景染色增加等情况。
       为了解决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主要是二甲本，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节，室温和试剂的新鲜程度进行调整。如果在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5 分钟就已足够。如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20 分钟或更长。
         在各种组织中都含有很多的内源性过氧化物酶，尤其在红细胞，中性粒细胞，单核细胞嗜酸性细胞，出血的组织坏死的组织等等。含有这种酶的各细胞和组织如果在染色前不对其进行处理和抑制，它们将会在 DAB 底物的显色时，与HRP一样催化底样，使之显色，使之生成与阳性物一样的黄棕色，造成混乱。
       为此，在免疫组化染色前，都必须对内源性过氧化物酶进行抑制。但抑制太厉害，对抗原也会有相同的抑制作用。氢在抑制内源性过氧化物酶时，也要注意对抗原的保护抑制也只能对它们中的大部分在 DAB 显色后，显示出淡黄色，这就足以与真正阳性物区别。抑制剂常用的是 0.3% 的 H2O2，也可将其称为 1% H2O2，因为市售的 H2O2 的浓度为 30%，按其净含量则为 0.3%，如果按其溶液的用量则为 1%。
       关于H2O2的使用，根据实验，认为 H2O2 甲醇较适合于大多数的情况，因为除了 H2O2 外，甲醇对各种酶，都有钝化的作用。
        为了减少背景产生的非特异性染色，在免疫组化染色的过程中，在加入一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色。
       抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分无特异性地结合(如胶原)。由于这种非特异性结合，将导致标记的部分局部化(轭合物)和胶原的假阳性染色。要用一种不相干的抗体居先处理，可能减少和标记的抗体无特异性结合。
以往，血清的使用有很多，如：小牛血清，马血清，山羊血清，绵羊血清，兔血清，浓度也有很多种，如：1%、2% 或 1：5、1：10、和 1:20，必须选择合适的抗体以及对作适当的保存和配制。

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